酶联免疫吸附实验(ELISA)双抗体夹心法检测衣原体

　　机理：

　　在保持酶分子的催化活性及免疫球蛋白分子(抗体)的免疫活性条件下，将酶分子标记与免疫球蛋白分子上，通过已知的表及抗体与待检抗原特异性结合形成抗原抗体复合物，在催化酶的底物，使酶底物发生颜色反应，从而惊醒抗原的定量与定性检测。

　　方法：

　　标本的采集处理

　　1、男性尿道标本 取材前2小时内不应排尿。用细杆棉签插入尿道3-4cm旋转并停留数秒，一去到足够量的尿道上皮细胞

　　2、女性宫颈标本 需要用棉签清洁宫颈口部再换一根插入宫颈口2cm，转动并停留数秒。并注意进出时无碰到阴道壁。为提高效率可宫颈与尿道同时去测检测。

　　3、直肠标本 将棉签肛门括约肌，在肛管内3cm沿肠壁转动并停留数秒。

　　取材后，短短棉签并立即置于衣原体保护液中，立即送检或冷冻于-70℃一下待检。冷冻带检标本检测前置于37℃水浴中迅速振摇融化。

　　实验步骤：

　　1、用已知特异性抗衣原体抗体(一抗)200ul包被酶标微量反应板，4℃过夜。

　　2、取出，弃去包被液，每孔加入1%胎牛血清白蛋白200ul，用以封闭微量反应板各孔中 的未结合剩余位点，加盖密封后放置于37℃孵育30分钟。

　　3、取出反应板，弃去上清液，用PBS-T磷酸盐吐温缓冲液洗涤三次，每次3-5分钟甩干。

　　4、分别加入200ul待检标本混悬液(棉拭子在保存页中京剧雷震荡处理后)及阴性对照、阳性对照物与微量反应各孔中，置于37℃孵育60分钟

　　5、洗涤同(3)

　　6、加已知特异性抗衣原体抗体(二抗),每孔200ul(与一抗来源相同),置于37℃孵育60分钟

　　7、洗涤

　　8、加酶标记抗IgG抗体每孔200ul，置于37℃孵育30分钟。一班使用的酶标记抗体滴度最好在1:2000以上，滴度太低时，非特异性反应增强，极易出现假阳性反应。

　　9、洗涤

　　10、加酶相应底物，每孔200ul，置37℃或室温15-30分钟，一班最为常用的酶及相应的底物有两种：一种为辣根过氧化物酶对应的底物为邻苯二胺，显棕黄色：另一种为碱性磷酸酶对应的底物为对硝基苯磷酸(二钠)盐，显黄绿色。

　　11、显色后，立即加终止液终止反应，每孔50ul。辣根过氧化酶用2MH2SO4、碱性磷酸酶用3NNaOH为终止液。

　　12、用酶标测定仪检测OD值或直接用肉眼观察结果。

　　结果判断：

　　1、用酶标测定仪检测OD值时

　　阴性对照OD值≤0.25

　　阳性对照的OD值≥0.50≤2.00

　　标本的阳性结果：OD>阳性对照平均值/2

　　即阳性对照平均OD值为一半以上为阳性

　　测定应在终止反应后1小时内完成

　　2、用肉眼直接观察时，应以阴性对照及阳性对照物的颜色变化作为参考，被测标本的颜色明显深于阴性对照者可以判为阳性。

　　适应证：

　　此实验为改良的ELISA双抗体夹心法，可应用于人类泌尿生殖道(尿道及宫颈)的粘膜上皮细胞、尿液及眼结膜等标本中检测属于特异性衣原体脂多糖抗体可检出10pg/ml抗原成分。灵敏度高，特异性强(敏感性约为75%-95%特异性约为90-98%),结果稳定可靠，并且可自动操作，广泛应用于标本的初筛实验。

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