实验技术——免疫球蛋白IgG的提取分离纯化技术

　　(一)材料与试剂配制

　　1.动物血清

　　2.硫酸铵饱和溶液

　　硫酸铵 800g~850g

　　H2O 1 000ml

　　加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28%NH4OH调pH至7.0(不调pH值也可以)。注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。

　　3.0.01Mol/L pH7.4PB液

　　A液：0.10Mol/L NaH2PO4液

　　NaH2PO4•2H2O 15.60g加H2O至 1 000.ml

　　B液：0.10Mol/L Na2HPO4液

　　Na2HPO4•12H2O 35.80g加H2O至 1 000ml

　　取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。

　　4.1%BaCl2溶液

　　5.纳氏液

　　HgI 115.00g

　　KI 80.00g加H2O至 500.00ml

　　溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。

　　6.0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。

　　7.洗脱液：0.03Mol/L的NaCl液。

　　8.透析袋(或玻璃纸)。

　　(二)操作方法

　　1.取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成20%(NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。

　　2.3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。

　　3.在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml，使成50%(NH4)2SO4溶液，充分混合，静置30min。

　　4.3000r/min离心20min，弃上清。

　　5.于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成33%(NH4)2SO4溶液，充分混合后，静置30min。

　　6.3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。

　　7.用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。

　　8.透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。

　　以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4+(取3~4ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH4+存在)，直至无 SO42-或NH4+出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。

　　9.离心去沉淀(去除杂蛋白)，上清液即为粗提IgG (即γ球蛋白，如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。

　　10.过DEAE-纤维素层析柱。(装柱过程见层析技术)。以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.03Mol/L NaCl)洗脱，收集洗脱液。

　　也可采用SephadexG150或G200柱。

　　11.蛋白质及其定量鉴定(见本章第八节)。

　　12.IgG的纯度鉴定 可采用下列方法之一鉴定。

　　⑴ 区带电泳：玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度(NH4)2SO4盐析样品进行电泳，以资比较。

　　⑵ 琼脂双相双扩散鉴定：预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。

　　⑶ 免疫电泳鉴定：(操作见第三章免疫电泳部分)。孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。

　　⑷ 圆盘电泳鉴定：用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。

　　13.IgG的浓缩与保存

　　⑴ IgG的浓缩：参看本章第九节。

　　⑵ IgG的保存：一般浓缩至1%以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。

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