华远——定量PCR(Polymerase Chain Reaction)技术

　　定量pcr(Polymerase Chain Reaction)技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。

　　一、广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：

　　(1)外参法+终产物分析。所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。

　　(2)内参法+终产物分析。所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。

　　(3)外标法+过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。

　　(4)内参法+过程监测。由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的taq酶和反应参与物，存在竟争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。

　　(5)外标法+过程监测+内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。

　　PCR过程的监测有多种检测模式。常用的有三种检测模式：

　　(1)R Green I 检测模式。温度循环为94—55—72°C三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。

　　(2)解探针模式(Taqman)Hydrolysis Probe 。温度循环为94—60°C二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当Taq酶在60°C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5`—3`外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。

　　(3)杂交探针(Hybridization Probes)模式。温度循环为94—55—72°C三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一个探针3`碱基上结合一个荧光染料，在另一个探针5`碱基上结合第二个荧光染料。在55°C时，两个探针都刚好接合在模板上，第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关，探针的浓度始终保持不变，因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。

　　二、狭义概念的定量PCR技术(严格意义的定量PCR技术)是指用外标法(荧光杂交探针保证特异性)通过监测PCR过程(监测扩增效率)达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。在国家没有出台阴阳判定标准时，所用PCR系统灵敏度达到一个拷贝(一个病毒)。从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性;一个拷贝数都没有才算阴性。

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