组织/细胞RNA快速提取

　　安徽华远技术：组织/细胞RNA快速提取 操作步骤：(实验前请先阅读注意事项)

　　提示：

　　次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量无水乙醇!

　　操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。

　　1. 组织培养细胞

　　a. 收集<107悬浮细胞到一个1.5ml离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接裂解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。

　　b. 13，000rpm离心10秒(或者300g离心5分钟)，使细胞沉淀下来。*吸弃上清，留下细胞团，注意不*弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。

　　c. 轻弹管壁将细胞沉淀*松散重悬，加入350μl(<5x106细胞)或者600μl(5x106-1x107细胞)裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。

　　d. 用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。

　　e. 接操作步骤项下3。

　　2. 动物组织(例如鼠肝脑)

　　a. 电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,加入350μl(<20mg组织)或者600μl(20-30mg组织)的裂解液RLT后电动*匀浆20-40秒。

　　b. 液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有350μl/600μl组织裂解液RLT的1.5ml离心管中, 用手剧烈振荡20秒，充分裂解。用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。

　　c. 将匀浆后裂解物13，000rpm离心3分钟,沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物, 将裂解物上清小心转到一个新离心管。

　　d. 接操作步骤项下3。

　　3. 较估计裂解物(上清)体积,加入等体积的70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。

　　4. 立刻将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13,000 rpm离心60秒，弃掉废液。

　　5. 加700μl 去蛋白液RW1，室温放置30秒，12，000rpm 离心30秒，弃掉废液。

　　如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。

　　6. 加入500μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。

　　7. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

　　8. 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water(事先在 70-90℃水浴中加热可提高产量)， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

　　9. 如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water重复步骤8, 合并两次洗脱液,或者使用次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。

　　洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。

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