华远化学| 血清γ—球蛋白的提纯
应用不同浓度硫酸铵分段盐析法将血清中γ—球蛋白与白蛋白及α、β球蛋白分离，最后用透析法或凝胶过滤法除去，即可得到比较纯的γ—球蛋白。
【操作】
一、盐析：
1. 取离心管一支加入血清1mL，加入等量PBS稀释血清，摇匀后逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，然后静置10分钟，再离心(4000转/分)15分钟，将上清液(主要含清蛋白)倾入试管中(留供后面实验用)。
2.离心管底部的沉淀用pbs缓冲液0.5mL搅拌溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵0.25mL(相当于33%饱和硫酸铵)，摇匀后再放置10分钟，离心(4000转/分)15分钟，倾弃上清液(主要含α、β球蛋白)，其沉淀即为初步纯化的γ—球蛋白。(如要得更纯的γ—球蛋白，可重复这步盐析过程2次)。
二、脱盐：
1.装柱：称取葡聚糖凝胶G-250 1g，放入100mL烧杯内加入蒸馏水约500mL，用小火煮沸1小时(注意：随时补充蒸馏水，以免干)静置冷却后倾弃上层蒸馏水，再加入PBS缓冲液10mL，将杯内的凝胶用玻璃棒轻轻搅拌使之悬起，倾入有少量玻璃棉(或尼龙布)堵住下口的20×1cm层析柱内，层析柱下口套一小段橡皮管。
待全部凝胶倾入柱内(注意：凝胶要装填均匀，若分多次加入凝胶应在放胶前将柱内凝胶顶部搅动悬起，再将凝胶液倾入)，且液面始终高于凝胶面，用螺旋夹调节PBS缓冲液的流速，控制在每分钟6滴，注意陆续不断的加入PBS缓冲液，不要使液面低于凝胶面。
2.脱盐：在盛有γ—球蛋白沉淀物的离心管内，加入PBS缓冲液5滴，并用玻璃棒轻轻搅拌，至全部沉淀物溶解后用滴管吸出γ—球蛋液，将滴管插入凝胶层析柱内，管口靠近凝胶面缓慢滴入3滴蛋白质液，待全部蛋白质液进入凝胶层后，用滴管轻轻靠近凝胶面加入PBS缓冲液30滴(注意：不要搅动凝胶面)，待大部分液体流入凝胶柱后，再陆续小心加入PBS缓冲液5~10mL，不要使液面低于凝胶面。洗脱流速始终控制在6滴/分。
3.收集：弃50滴后，用干净的小试管，编号每管收集凝胶柱洗脱液10滴，分别进行检测。
4.检测：准备干净的反应板两块，每块反应板各孔依次各加入各管收集的液体1滴，然后在一块反应板每孔再加入奈氏试剂1滴，(检查NH4+存在，呈黄色到橙色)，记录下各孔的颜色变化。另一块反应板每孔各加入双缩脲试剂1滴，观察双缩脲反应的呈色深浅，用(-)、(+)、(++)、(+++)表示。将呈色最深的孔所对应的管内液体留供浓缩实验用。
以上操作可参照操作简介进行。
【操作简介】
待缓冲液全部进入层析柱，用长滴管吸取γ—球蛋白溶液(弃泡沫)，管口靠近凝胶面缓慢滴入γ—球蛋白溶液4滴，待溶液进入层析床面后，加入PBS缓冲液3滴，待再进入床面后，再加入PBS缓冲液30滴;层析柱下弃洗脱液50滴。再用干净小试管，每管收集洗脱液10滴。直到洗脱液和奈氏试剂反应无色，拧紧螺旋夹。
检测：一块反应板每孔加双缩脲试剂1滴，检测蛋白质，另一块反应板每孔加奈氏试剂1滴，检测NH4+。
一、透析和浓缩
取玻璃纸(15×15cm)一张，折成袋状。将前面第一次盐析得到的含清蛋白上清液倾入袋内，用线绳缚紧上口，用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下部浸入水中。将杯放置1小时以上，(中间换水1~2次)，然后将透析袋取下，小心将线绳解开，用滴管吸出袋内液体放入干净试管中，用双缩脲法分别检查袋内液体有无蛋白质。再用奈氏试剂检查袋外(烧杯中)液体的NH4+，观察透析法除盐的效果，这种方法亦用于其他蛋白质(如γ—球蛋白)的脱盐。
另取玻璃纸一张，同上法将前面凝胶过滤除盐得到的γ—球蛋白溶液放入透析袋内，悬于盛有10mL浓蔗糖或聚乙醇溶液的小烧杯内，同样放置1小时以上，观察袋内液体体积的变化，小心收集袋内液体入小瓶内，置冰箱保存供以后实验用。
【试剂】
1. 免疫血清
2. PBS(磷酸盐缓冲生理盐水——用0.1M磷酸盐缓冲液(pH=7.2)配制的0.9%NaCl溶液。
3. pH7.2饱和硫酸铵溶液——用浓氨水将饱和硫酸铵溶液调pH至7.2。
4. 葡聚糖凝胶G-250。
5. 奈氏试剂：
(1)贮备液：取碘化钾150g、碘110g、水100mL，移入250mL锥形瓶中，再加汞150g，分别摇荡10~15分钟，至碘完全溶解，此时溶液温度逐渐升高，由红色变为浅棕色，将锥形瓶置于流水下冷却，继续摇荡，至溶液为米黄色为止，倾入溶液置2000mL容量瓶中，将沉淀用水多次洗涤倾入瓶中，然后加水至2000mL刻度，混匀。
(2)应用液：倒上述溶液30mL，加入10%NaOH140mL，加水30mL混匀，即为奈氏试剂(奈氏试剂的主要成分是碘化钾汞复盐)
碱度要求：20mL1MHCl消耗奈氏试剂11~11.5mL。
6. 双缩脲试剂：
硫酸铜250g加水100mL，加热助溶，取酒石酸钾钠10g、碘化钾5g溶于500mL水中，再加20%NaOH30mL，混匀，然后将硫酸铜溶液倾入，加水至1000mL。
7.浓蔗糖溶液——饱和蔗糖溶液。
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