抗体是获得性免疫的重要组成部分，在防御性及致病性的免疫反应中起到关键作用，又因其具有高度靶向特异性、亲和力和安全性,已经在许多重大疾病的治疗、诊断和预防中得到广泛应用, 是当今新药研发的一个重点。而获得医用单克隆抗体或抗体片段的基因序列是进行抗体工程及抗体人源化改造的前提，是实现其功能优化至关重要的第一步。DNA测序技术的长足发展为获取抗体基因奠定了坚实的基础，特别是随着高通量测序技术的发展和成熟，使得分析抗体基因序列,特别是针对大容量、多样性高的抗体基因库序列的系统分析成为可能。

 图1 利用高通量测序技术进行抗体制备高通量测序概要

    高通量技术堪称测序技术发展的一个里程碑，该技术可以对数百万个DNA分子同时进行测序。使得对一个物种的转录组和基因组进行全貌分析成为可能，因此也称为深度测序（deep sequencing）或者下一代测序（next generation  sequencing）。

 图2 三种具有代表性的下一代测序技术

    高通量测序最具代表性测序平台有三种（图2）：1，2005年454 Life Sciences公司推出的454 FLX焦磷酸测序平台（454 FLX pyrosequencing platform），2006年Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台（Genome Analyzer platform），以及2007年ABI公司推出的SOLiD测序仪（ABI  SOLiD sequencer），他们的共同点是都具有高测序通量，根据平台不同读取长度从25bp到450bp不等，这样一次可以读取到1G到14G不等的碱基信息，这是传统的96道毛细管测序无法达到的。

三大高通量测序技术原理简述

    454  FLX焦磷酸测序：

 图3 454 FLX pyrosequencing原理

    该技术是酶级联化学发光反应。首先在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP 的聚合与一次荧光信号释放偶联起来 (图3)。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，在每一轮测序反应中只加入一种dNTP。若该dNTP与模板配对，就会释放一个焦磷酸。焦磷酸盐被磷酸化酶转化成为ATP，从而促使氧合荧光素的合成同时释放出光信号。释放的光信号被CCD检测后通过软件转化为一个峰值，峰值与反应中参入的核苷酸数目呈正比，这样就可以确定待测模板的碱基序列。

    Solexa和SOLiD测序技术：核心思想都是边合成边测序，即生成新DNA互补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化成一个测序峰值，获得互补链序列信息。

    由此可见第二代测序技术无需进行电泳，操作简便。这不但大大节省了成本和时间，而且可以对数以百万计的样品进行分析，这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。

DNA测序技术在抗体研发的发展历程

    随着测序技术的发展，抗体组学的研究经历了从低通量到高通量的技术变革。在1990~2000年间，主要利用RT-PCR扩增技术和Sanger测序技术研究少量B细胞的抗体特征。由于技术的低通量性，每次实验只能分析几十到几百个B细胞的抗体特性，与抗体谱的巨大数据相比，低通量技术只为我们揭示了抗体序列信息的冰山一角。

    2009年Weinstein等首次应用高通量测序技术全面研究了斑马鱼的抗体库特征，揭示不同斑马鱼个体间重链VDJ基因的使用频率存在相似性，促进了高通量测序技术在人抗体组分析中的应用。下一代测序技术的应用使得一次测序可获得数以百万计的B细胞的抗体可变区域序列，数据量更加接近人体抗体谱真实数量，抗体的研究从而进入大数据时代。

高通量DNA测序技术在抗体领域中的应用

    大容量和多样性好的抗体基因库是成功筛选功能抗体的基础。目前用于基因库筛选的所有展示技术均采用了一种表型选择压力的原理,即依赖于受体-配体的竞争结合力,这样的筛选过程一方面通过展示技术富集了目标抗体基因,另一方面可能导致筛选环节中的一些稀有分子、低结合力分子、可溶性表达量过低的分子或产量较低的抗体基因被漏筛。例如在筛选抗病毒的中和性抗体过程中,经常发现获得的高亲和力抗体没有较好的中和作用,这是因为获得的高亲和力抗体并不是针对中和作用的靶标,因而获得的抗体是不相关的抗体。

    而DNA测序过程没有选择压力,可以释放较完整的基因库的序列信息,有利于捕获目标基因。传统的Sanger法在DNA测序的通量上一般最大为100kb,96孔,远不能满足库容在109分子以上的抗体基因库分析的需求,而新一代高通量DNA测序技术的出现为实现抗体基因库测序提供了可能。

    近年来高通量DNA测序技术在抗体领域中的应用不断增加,目前主要集中在对重组抗体库多样性的分析及基于抗体可变区CDR3序列测序结果的应用。

展望

    随着高通量DNA测序技术发展，分子生物学技术及重组抗体技术的不断完善，快速检测大容量重组抗体基因库及快速发现药用抗体基因的时代到来，对整个抗体药物研发产生巨大推动作用。但到目前为止，抗体组学分析技术仍受到一些现实条件的约束，如高通量PCR抗体基因扩增技术仍不够完善、测序读段长度与准确性还有待进一步提高、标准的分析流程有待开发完善。随着单细胞分选及测序的应用、PCR扩增基因方法的改善、细胞标记的应用、分析标准的开发，未来抗体组学将在诊断、药理学、疫苗设计及临床应用中发挥前所未有的重大作用，引领新型治疗性抗体研究的时代。