发布时间:2021-11-29 15:25:00

WB检测细胞因子表达

一、所用抗体信息:

 

二、主要试剂与耗材

全蛋白抽提试剂盒(安徽华远经济发展有限公司)

BCA蛋白含量检测试剂盒(安徽华远经济发展有限公司   )

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(安徽华远经济发展有限公司   )

预染蛋白分子量(安徽华远经济发展有限公司   )

5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(安徽华远经济发展有限公司   )

1×Tris-甘氨酸蛋白电泳缓冲液(安徽华远经济发展有限公司)

Western Blotting检测试剂盒(安徽华远经济发展有限公司)

显影定影试剂(安徽华远经济发展有限公司)

 

三、主要仪器与设备

电泳仪(美国 Bio-rad Power Supplies Basic)

Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统(美国 Bio-rad  170-4150)

凝胶成像系统(英国 SYNGENE G:BOXChemiXR5)

台式恒温振荡器(中国 上海精宏实验设备有限公司 THZ-312)

涡旋振荡器(中国 海门其林贝尔 XW-80A)

高速冷冻离心机(美国 Thermo Sorvall ST 16R)

多功能酶标仪(美国 MD Spectramac M3)

PH计(美国 OHAUS STARTER 2C)

分析天平(中国 精密分析天平 JA3003)

移液器(德国 eppendorf  2.5/10/200/1000μL)

 

四、实验方法

1.配置Western 所需的全部溶液

1. 1.5M Tris,PH 8.8

Tris Base   18.16g

双蒸水     80ml

溶解后,浓盐酸调PH至8.8,定容至100ml,4℃保存。

2. 0.5M Tris,PH 6.8

Tris Base   18.16g

双蒸水     80ml

溶解后,浓盐酸调PH至6.8,定容至100ml,4℃保存。

3.10%AP(过硫酸铵)

AP    1g

双蒸水 10ml

溶解后,分装冻存。

4. 10* Running buffer

Tris      30g

甘氨酸  144g

SDS     10g

去离子水定容至1000ml。4℃保存。

使用时:取100ml,加入900ml去离子水,充分混匀。

5. 10*Trans buffer

     甘氨酸  144g

      Tris     30g

     去离子水定容至1000ml

  使用时:10* Trans buffer   100ml

           甲醇            200ml

          去离子水定容至  1000ml

现用现配。 

6.  10*TBS  

        Tris   24.2g

        Nacl   80g

        双蒸水定容  1000ml

7. TBS-T

        10*TBS   100ml

         Tween 20  1ml

      双蒸水定容  1000ml

8.封闭液

         脱脂奶粉    5.0g

         TBS-T      100ml

2. 蛋白样客户提供。

      浓缩胶10%,分离胶5%。上样10ml。

电泳:

 浓缩胶 60V 30min;

      分离胶 120V 60min 直至溴酚蓝跑到底端。

上样顺序:

见结果分析。

 

湿转: 

110V 90min

      转膜的顺序:固定盒打开,黑色一面向下:从下到上依次是:纤维垫,滤纸,胶,PVDF膜(左上角剪角做标记),滤纸,纤维垫。玻璃棒挤压空气。整个系统置于冰盒内。

封闭:

5%脱脂奶粉,室温条件,封闭2h。现用现配(TBS-T稀释)。

孵育一抗:

取抗体10ml,新配的TBS-T稀释至10.0ml,置于parafilm封口膜上(注意PVDF膜的正反面),4℃孵育过夜。

内参:取抗体2 ml,新配的TBS-T稀释至20.0ml,置于parafilm封口膜上(注意PVDF膜的正反面),4℃孵育过夜。

孵育二抗:

TBS-T洗涤六次,每次10min;羊抗兔HRP(武汉博士德,11000取抗体1 ml,新配的TBS-T稀释至1ml,置于parafilm封口膜上(注意PVDF膜的正反面),室温孵育2h。

显色:

TBS-T洗涤三次,每次10min。ECL显色液(millipor)溶液A 0.5ml 溶液B 0.5ml。混合均匀后显色。凝胶成像,蛋白质印迹成像和定量分析系统(Quantitative Gel and Western Blot Imaging System)(型号: FluorChem Q)显色,曝光。

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