HE、免疫组化实验方法

一、实验材料

1、样品：

2 免疫组化试剂：

 二、HE染色步骤：

1．取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。

2．切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。

3．苏木素染色5分钟，自来水冲洗。

4．盐酸乙醇分化30秒。

5．自来水浸泡15分钟或温水（约50℃）5分钟。

6．置伊红液2分钟。

7．常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（I）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。

三、免疫组化步骤：

1、取材：取实验组和对照组动物组织尽可能新鲜，PBS洗，取小于0.5cm×0.5cm×0.1cm组织块；

2、固定和包埋：用4%多聚甲醛进行固定，经70%乙醇30分钟、80%乙醇30分钟、90%乙醇30分钟两次、95%乙醇30分钟两次、100%乙醇30分钟两次、二甲苯透明15分钟两次、55℃石蜡中1小时三次，用不锈钢模具包埋组织块；

3、切片：将厚度5um的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60℃过夜；4、脱蜡、入水：将切片浸于二甲苯中5分钟两次、100%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、90%乙醇5分钟两次、85%乙醇5分钟次、70%乙醇5分钟两次，自来水冲洗，PBS洗两次；

5、抗原修复:柠檬酸缓冲液，热修复20分钟， PBS洗3次×5分钟；

6、3%双氧水,室温10分钟, PBS洗3次×5分钟；

7、切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，不洗；

8、切片上滴加第一抗体，4℃过夜，PBS洗3次×5分钟；

9、切片上滴加生物素化第二抗体（IgG），37℃20分钟，PBS洗3次×5分钟；10、切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20分钟，PBS洗3次×5分钟；

11、DAB显色：使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上，显色6分钟，充分水洗；

12、复染：苏木素1分钟，充分水洗，1%盐酸酒精分化，1%胺水反蓝，充分水洗；

13、封片：经70%乙醇5分钟、80%乙醇5分钟、90%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、100%乙醇5分钟两次脱水、二甲苯透明5分钟两次、中性树脂封片；14、显微镜观察：选择实验组和对照组的阳性组织相、进行400×的显微照相。

15、图像分析：选择有意义的组织相，经登录、编号、采集、分析、读取数据、最后存盘。

四、仪器设备

一、显微镜：日本奥林巴斯  BX51T-PHD-J11

二、CMOS: 日本奥林巴斯

三、多功能真彩色细胞图象分析管理系统：美国Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus 6.0

四、切片机：德国徕卡RM2016

五、离心机：北京离心机厂LDZ5-2型

六、电子天平：瑞士METTER AE100型

七、移液器：德国EPPENDORF

八、干燥箱：日本三洋MIR-153型

九、低温冰箱：日本三洋MDF-382E型

十、恒温水浴箱：江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型

十一、医用微波炉：浙江临安爱迪仪器厂YWY781B型

五、实验数据

详见附件