发布时间:2021-11-29 15:23:00

HE、免疫组化实验方法

一、实验材料

1、样品:

 

2 免疫组化试剂:

 

 二、HE染色步骤:

1.取材组织块,经固定后,常规石蜡包埋,4μm切片。

2.切片常规用二甲苯脱蜡,经各级乙醇至水洗:二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100%乙醇2min→95%的乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸馏水洗2min。

3.苏木素染色5分钟,自来水冲洗。

4.盐酸乙醇分化30秒。

5.自来水浸泡15分钟或温水(约50℃)5分钟。

6.置伊红液2分钟。

7.常规脱水,透明,封片:95%乙醇(I)min→95%乙醇(Ⅱ)1min→100%乙醇(I)1min→100%乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封固。

三、免疫组化步骤:

1、取材:取实验组和对照组动物组织尽可能新鲜,PBS洗,取小于0.5cm×0.5cm×0.1cm组织块;

2、固定和包埋:用4%多聚甲醛进行固定,经70%乙醇30分钟、80%乙醇30分钟、90%乙醇30分钟两次、95%乙醇30分钟两次、100%乙醇30分钟两次、二甲苯透明15分钟两次、55℃石蜡中1小时三次,用不锈钢模具包埋组织块;

3、切片:将厚度5um的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上,60℃过夜;4、脱蜡、入水:将切片浸于二甲苯中5分钟两次、100%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、90%乙醇5分钟两次、85%乙醇5分钟次、70%乙醇5分钟两次,自来水冲洗,PBS洗两次;

5、抗原修复:柠檬酸缓冲液,热修复20分钟, PBS洗3次×5分钟;

6、3%双氧水,室温10分钟, PBS洗3次×5分钟;

7、切片上滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体,不洗;

8、切片上滴加第一抗体,4℃过夜,PBS洗3次×5分钟;

9、切片上滴加生物素化第二抗体(IgG),37℃20分钟,PBS洗3次×5分钟;10、切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP),37℃20分钟,PBS洗3次×5分钟;

11、DAB显色:使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴,混匀,加至标本上,显色6分钟,充分水洗;

12、复染:苏木素1分钟,充分水洗,1%盐酸酒精分化,1%胺水反蓝,充分水洗;

13、封片:经70%乙醇5分钟、80%乙醇5分钟、90%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、100%乙醇5分钟两次脱水、二甲苯透明5分钟两次、中性树脂封片;14、显微镜观察:选择实验组和对照组的阳性组织相、进行400×的显微照相。

15、图像分析:选择有意义的组织相,经登录、编号、采集、分析、读取数据、最后存盘。

四、仪器设备

一、显微镜:日本奥林巴斯  BX51T-PHD-J11

二、CMOS: 日本奥林巴斯

三、多功能真彩色细胞图象分析管理系统:美国Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus 6.0

四、切片机:德国徕卡RM2016

五、离心机:北京离心机厂LDZ5-2型

六、电子天平:瑞士METTER AE100型

七、移液器:德国EPPENDORF

八、干燥箱:日本三洋MIR-153型

九、低温冰箱:日本三洋MDF-382E型

十、恒温水浴箱:江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型

十一、医用微波炉:浙江临安爱迪仪器厂YWY781B型

 

五、实验数据

详见附件

 

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