原理

DNA合成的方法主要采用固相亚磷酰胺三酯法，运用此方法的DNA合成仪有很多，常用的有ABI 394合成仪、ABI39OO高通量合成仪，它们的区别主要在合成效率，试剂用量，耗时等方面，合成的原理是相同的，合成原理如图：

Step 1：DMTro是5’羟基的保护基团，用TCA（三氯乙酸）和预先连接在固相载体（CPG）上的核苷酸的5’端发生反应，脱去DMT，使5’羟基端游离

Step 2：亚磷酰胺保护的dNTP和活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，此时3’端被活化，5’-羟基被DMTro保护

Setp 3：1、2步的产物发生缩合反应偶联，形成新键C-亚磷酯键

Setp 4：1中会剩下部分未参与反应的5’-羟基，通过乙酰化的方法封闭5’-羟基

Setp 5：3步形成的C-亚磷酯键不稳定，易被水解，所以用氧化剂碘将其氧化成更稳定的磷酸三酯键

通过以上步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体上，将其5’端的DMTro切除，重复以上步骤合成所有需要的碱基，最后经过氨水高温处理，将合成的链从固相载体CPG上切下来，根据不同的下游应用纯化处理后保存。

PCR扩增简单方便，但不能保证基因序列的完全正确性，扩增存在突变风险，且PCR对模板也具有一定的要求，因此适用性存在局限性，相对于此基因合成具有如下优势：

优势

1. 可以保证基因序列的完全正确性，无突变

2. 合成周期短

3. 不受模板来源限制

4. 根据不同应用，设计优化基因序列，提高表达水平

应用

人工基因合成具有极大的灵活性，根据需求自行改变设计序列

1. 进行基因优化，提高基因表达

2. 合成已知序列的难扩增基因

3. 合成大量用于微芯片的cDNA

4. 克隆人鼠抗体或重组抗体

5. 设计合成基因疫苗、基因治疗载体

6. 根据基因的结构功能研究，修改设计基因

7. 合成不同的基因突变株、SNPS、或其它突变株