标签：核酸提取试剂 蛋白酶K 华远化学 生物制剂
华远技术全面解析：核酸提取加蛋白酶K的原理
随着新冠疫情的发展，新冠病毒核酸的检测工作已趋于常态化。而优质的核酸提取试剂是核酸检测的基础，正确提取核酸才能保证下游检测结果的质量。
市场上核酸提取的试剂成分虽然各有差别，但蛋白酶K由于其独特的广谱蛋白水解酶活性和稳定性，目前已成为了多种提取试剂的重要原料。另外，在临床实践中，特别是我国目前正在推行20混1检测的场景下，难免会遇到复杂样本（例如含有“痰液”的样本）；而蛋白酶K在处理特殊样本时，更能突显出作用。
蛋白酶K广泛应用于核酸提取
蛋白酶K来源于林伯氏白色念球菌，是一种丝氨酸蛋白酶，具有较强的稳定性和广谱蛋白水解酶活性，目前广泛应用于核酸提取中。
01、【蛋白水解酶活性】
蛋白酶K可作用于多种蛋白，在病毒核酸提取检测中发挥多重作用：
（1）裂解病毒的外壳蛋白，暴露核酸分子，并且病毒外壳蛋白失活可进一步保证运输和检测阶段更安全；
（2）降解与核酸紧密结合的组蛋白，使得核酸游离到提取液中，有利于进一步纯化；
（3）降解RNA酶，防止病毒RNA的降解，有利于核酸检测。
02、【稳定性】
蛋白酶K能在多种环境[pH（4-12.5），高盐缓冲液，70℃的高温等]中保持活性。另外，蛋白酶K的活性不受SDS、尿素、EDTA、盐酸胍、异硫氰酸胍等的抑制，且一定含量的去垢剂还可以增强蛋白酶K的活性。
03、蛋白酶K在新冠指南、政策文件均有推荐
学术指南和政策文件中，均提及蛋白酶K的应用。
早在2020年4月疫情暴发伊始，中华医学杂志发布了《2019新型冠状病毒核酸检测专家共识》，提出收集痰液于采样杯中，采样杯里需装入2mL蛋白酶K（1g/L）。
04、相关研究提示蛋白酶K对复杂样本核酸提取具有重要作用
新冠的核酸采样主要采集口咽拭子和鼻咽拭子样本，但在临床实际工作中，难免会采集到一些复杂样本，例如：痰液等。《2019新型冠状病毒核酸检测专家共识》中引用的研究[4]提示，在复杂样本的提取核酸，使用蛋白酶K效果更佳。
在该研究试验中，SungH等采用了蛋白酶K和其他两种方法，提取痰液标本中的核酸（RNA），并使用荧光PCR仪对三种方法提取的核酸进行分析比较。试验显示，另外两种方法提取核酸检测结果中，假阴性率分别为16.7%和13.3%；使用了蛋白酶K处理的样本，检测结果并无假阴性。另外，蛋白酶K组PCR检测的Ct值范围在31.1-35.4之间，而另外两种方法学PCR检测的Ct值范围分别为34.7-39.0和33.9-38.6。
另外，Saber Khelaifia等对粪便标本中的细菌DNA进行提取，结果显示使用蛋白酶K可以提高DNA的提取量。Tomoo Jikuzono使用蛋白酶K对液基细胞溶液固定的甲状腺细胞进行处理后，提高了RNA回收率。
蛋白酶K增加核酸提取量可能的原因为：
（1）复杂样本（如：痰液样本）中存在着一些可PCR反应的物质（可抑制PCR的物质，例如糖蛋白，免疫球蛋白等物质就是PCR的抑制物），使用了蛋白酶K可最大程度清除该类物质，保证PCR结果准确性；
（2）复杂样本的核酸提取过程中，易残留较多RNA酶，使用蛋白酶K可最大程度灭活RNA酶，防止病毒RNA的降解，有利于核酸检测。
也有一些研究提示，蛋白酶K在复杂样本的处理中并未显示突出作用。这可能与使用的蛋白酶K活性不同有关，另一种可能是与使用场景有关，蛋白酶K加入裂解液之中，若作者长时间放置，蛋白酶K会失活，此时就会得到加不加蛋白酶K没有作用的结论），未来仍需大量研究进一步探索。
目前，新冠疫情依然在全球肆虐，核酸提取检测已趋于常态化。在临床实践中，特别是“10混1”或“20混1”检测的场景下，难免会遇到复杂样本（例如含有“痰液”的样本）；而蛋白酶K在处理特殊样本具有独特作用。未来我们需进一步深挖多种提取检测使用场景，探索最佳使用方案，以期更好的控制疫情。
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